新的基因筛选平台使用CRISPR技术,以大规模并行的方式瞄准数千个基因

准确、快速地找到检测、靶向和敲除特定RNA靶标的最佳指南的方法,可用于探测人类基因组的暗物质以及冠状病毒和流感等RNA病毒

TARGETING RNA: Cas13 enzymes traveling along a RNA landscape. Artist: Christian Stolte

TARGETING RNA: Cas13 enzymes traveling along a RNA landscape. Artist: Christian Stolte, courtesy of New York Genome Center

基于crispr的基因筛选技术已经帮助科学家们识别在镰状细胞贫血、癌症免疫治疗、肺癌转移和许多其他疾病中起关键作用的基因。然而,这些基因筛选的范围是有限的:它们只能编辑或定位DNA。对人类基因组的许多区域来说,以DNA为靶点可能并不有效,而其他生物,如冠状病毒或流感等RNA病毒,则无法通过现有的DNA靶向CRISPR屏幕进行定位。

现在,科学界的一个重要的新资源今天发表在《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上,纽约基因组中心(new York Genome Center)和纽约大学(new York University)内维尔·桑贾纳(Neville Sanjana)实验室的研究人员开发了一种针对RNA的新型CRISPR筛选技术。

研究人员利用了最近发现的一种名为Cas13的CRISPR酶,这种酶的目标是RNA而不是DNA。利用Cas13,他们设计了一个优化的平台,在RNA水平上对人类细胞进行大规模的基因筛选。这种筛选技术可以用于了解RNA调控的许多方面,并识别非编码RNA的功能,非编码RNA是产生的RNA分子,但不编码蛋白质。

通过针对人类RNA转录本中的数千个不同位点,研究人员开发了一种基于机器学习的预测模型,以加速识别最有效的Cas13指导RNA。这项新技术可以通过一个互动网站和开源工具箱提供给研究人员,用于预测自定义RNA目标的指导RNA效率,并为所有人类蛋白编码基因提供预先设计的指导RNA。

“我们预计RNA-targeting Cas13酶将分子生物学和医学应用上有很大影响,然而对指导RNA设计针对功效高,”娜说,纽约大学生物学助理教授,纽约大学的神经学和生理学助理教授格罗斯曼医学院的一个核心教员在纽约基因组中心,和该研究的资深作者。“我们打算通过深入和系统的研究来改变这一现状,以开发最有效的指南设计的关键原则和预测模型。”

Cas13酶是VI型CRISPR酶(有规律的间隔短回文重复),最近被鉴定为可编程rna导向的rna靶向蛋白,具有核酸酶活性,允许目标基因敲除而不改变基因组。这种特性使Cas13成为一种潜在的重要治疗手段,可以在不永久改变基因组序列的情况下影响基因表达。

“这就是我们在纽约基因组中心培育和发展的技术创新。这项来自Sanjana实验室的最新CRISPR技术对推进基因组学和精准医疗领域具有令人兴奋的意义,”纽约基因组中心Evnin家庭科学主任兼首席执行官Tom Maniatis说。

博士后科学家Hans-Hermann Wessels和博士生Alejandro Mendez-Mancilla是该研究的共同第一作者,他们开发了一套基于cas13的新工具,并对哺乳动物细胞进行了转录平铺和排列筛选。研究人员总共收集了超过24000个rna定位指南的信息。

“我们在许多不同的转录本中加入了引导rna,包括几个人类基因,我们可以通过抗体染色和流式细胞术很容易地检测转录本的敲除,”韦塞尔斯说。“在此过程中,我们发现了一些有趣的生物学发现,这可能会扩大rna靶向Cas13酶的应用。”

例如,在研究小组的发现中,有一项是关于在识别目标RNA时,向导RNA的哪些区域更重要。他们使用了数千个含有1、2或3个单字母不匹配目标RNA的导向RNA,识别出一个关键的“种子”区域,该区域对CRISPR导向与目标之间的不匹配非常敏感。这一发现将有助于科学家设计指导rna,以避免非预期目标rna的脱靶活性。由于一个典型的人类细胞大约表达100,000个rna,因此,准确定位Cas13的预定靶点对于筛选和治疗应用至关重要。

除了进一步加深我们对Cas13离靶点的理解,“种子”区域还可以用于下一代生物传感器,可以更精确地区分密切相关的RNA物种。总而言之,本研究将先前Cas13研究中哺乳动物细胞的数据点增加了两个数量级以上。

Mendez-Mancilla说:“我们特别兴奋地使用优化的Cas13筛选系统来针对非编码rna。”这大大扩展了CRISPR工具箱,用于正向遗传和转录组筛选。在这项研究中,研究人员注意到,当针对信使rna的不同蛋白编码和非编码元件时,蛋白质的敲除有显著差异,并发现Cas13与参与转录处理和剪接的其他rna结合蛋白竞争的证据。

该团队最近利用他们的指南RNA预测模型进行了一项特别关键的分析:covid19公共卫生突发事件是由一种冠状病毒引起的,这种病毒含有RNA而非dna基因组。利用从大量平行屏幕中得到的模型,研究人员已经确定了最优的指导rna,可以用于未来的检测和治疗应用。在纽约分离出的SARS-CoV-2菌株的Cas13指导rna的预测已经在网上发布:http://bit.ly/coronavirs-guides

可以在http://cas13design.nygenome.org上找到用于对Cas13指导rna进行预测评分的web工具。这项研究的其他合著者包括纽约大学和纽约基因组中心的Mateusz Legut、Zharko Daniloski和Xinyi Guo。

媒体接触

Rachel Harrison

Rachel Harrison

(212) 998-6797

新闻旨在传播有益信息,英文原版地址:https://www.nyu.edu/content/nyu/en/about/news-publications/news/2020/march/new-genetic-screening-platform-using-crispr-technology-for-targe.html

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